Patch Clamp | Patch Clamp

PALABRAS CLAVE: Electrofisiología, micromanipulación

DEFINICION:

Una técnica electrofisiológica para medir corriente eléctrica que pasa a través de la membrana en un canal sencillo en células.

TECNOLOGÍA:

La técnica de patch clamp (desarrollada por Nher y Sakmann) usa un micropipeta de vidrio con un diámetro suave con una abertura de aproximadamente 1um. Esto contrasta con microelectrodos nítidos que se usan con frecuencia en otras técnicas electrofisiológicas. La pipeta se llena con una solución que depende del estudio específico o la técnica de patch clamp usada. Un electrodo de metal en contacto con esta solución conduce cambios eléctricos a un amplificador de voltaje. Este esta presionado contra la membrana celular y se aplica succión para absorber la membrana dentro de la pipeta con el electrodo para formar un sello eléctricamente apretado de “giga-ohm”. En el patch clamp un solo electrodo se usa para hacer el patch clamp de la membrana celular habilitando el mantener el voltaje en un nivel constante mientras que se graban los cambios de corriente. En forma similar la corriente en la célula puede ser anclada a la corriente y grabar los cambios de voltaje. Hay algunas variantes de la técnica de patch clamp que se pueden realizar incluyendo, por ejemplo:

Patch Clamp Planar: en lugar de pipetas de vidrio, se usa una superficie plana puncionada con pequeños hoyos.

Patch célula-pegada: el electrodo se mantiene sellado a la membrana celular mientras que la solución en la pipeta se altera (por ejemplo, por la adición de drogas) y se graba la actividad de los cambios resultantes.

Patch de adentro hacia fuera: Donde el área “succionada” de la membrana se desprende de la célula y se expone a la superficie intracelular de la membrana – la que en cambio se puede exponer a varios medios conteniendo, por ejemplo, varios ligantes intracelulares.

Patch de célula completa: Donde se incrementa la succión rompe la membrana y brinda acceso del electrodo al ambiente intracelular por un periodo de tiempo corto el ambiente intracelular es diluido por los contenidos de la pipeta.

APLICACIONES:

La técnica es usada para estudiar células excitables, por ejemplo, aquellas que producen una pequeña corriente eléctrica cuando se estimulan. Estas incluyen principalmente células nerviosas y fibras musculares.

CONFIGURACIÓN DEL MICROSCOPIO:

Cualquier aplicación de electrofisiología incluyendo el patch clamp coloca una gran demanda en la configuración del microscopio en términos de estabilidad, supresión de vibración, aislamiento de interferencia eléctrica, espacio para manipuladores y acceso al espécimen. La estación de trabajo de fisiología FN1 de Nikon, ha sido diseñada especialmente para cubrir las demandas de electrofisiología  con manipulación eficiente y un ruido mínimo.

SISTEMA RECOMENDADO:

En el diseño del FN1, Nikon ha minimizado el ruido eléctrico usando iluminación de fibra para llevar luz al sistema desde fuera de la jaula y conectando pines a tierra en todas las partes principales del microscopio. La vibración se minimiza con la rígida construcción y se reduce el temblor cuando se gira el porta-objetivos y aumentos. La forma simple y delgada con forma de I en el cuerpo brinda más espacio de trabajo y un mejor acceso alrededor del microscopio para posicionar los manipuladores y otros periféricos. El condensador, sub-platina y torreta se pueden remover por completo del cuerpo del FN1 para obtener más espacio libre, dependiendo del experimento. Además, la altura de la platina fija puede cambiarse fácil y rápidamente por el usuario. Los objetivos de inmersión en agua están aislado de la transmisión eléctrica y térmica. El objetivo 16x tiene un amplio ángulo de aproximación de 45° y una distancia de trabajo de 3.0mm para un acceso fácil y una observación mejorada. La combinación del objetivo 16x (con gran A. N.) en combinación con un cambiador de aumentos intermedio permite a los usuarios realizar experimentos de patch clamp sin cambiar el objetivo. El FN1 puede ser usado en combinación con el sistema confocal C1. Con el eje z motorizado (opcional) y el software mejorado del C1, los usuarios pueden realizar análisis de imágenes, reconstrucción 3D de rebanadas, y puede obtener imágenes 3D y datos electrofisiología alternativos desde el mismo espécimen. Los usuarios pueden cambiar rápidamente entre la iluminación IR y DIC-IR para asegurar el reconocimiento preciso de las micro aguja y mejorar el contraste flexible. El microscopio también permite a los usuarios selecciona la longitud de onda IR específica para cada tipo de espécimen:

700-750nm para imágenes de alto contraste de especímenes delgados con estructuras finas

800-900nm para imágenes de alto contraste de especímenes gruesos con estructuras profundas

Oblicua IR descentrada que brinda contraste flexible desde varios ángulos

LIGAS: