Patch Clamp
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Patch Clamp
PALABRAS
CLAVE:
Electrofisiología, micromanipulación
DEFINICION:
Una técnica
electrofisiológica para medir corriente eléctrica que pasa a través de la
membrana en un canal sencillo en células.
TECNOLOGÍA:
La técnica
de patch clamp (desarrollada por Nher y Sakmann) usa un micropipeta de
vidrio con un diámetro suave con una abertura de aproximadamente 1um. Esto
contrasta con microelectrodos nítidos que se usan con frecuencia en otras
técnicas electrofisiológicas. La pipeta se llena con una solución que
depende del estudio específico o la técnica de patch clamp usada. Un
electrodo de metal en contacto con esta solución conduce cambios eléctricos
a un amplificador de voltaje. Este esta presionado contra la membrana
celular y se aplica succión para absorber la membrana dentro de la pipeta
con el electrodo para formar un sello eléctricamente apretado de “giga-ohm”.
En el patch clamp un solo electrodo se usa para hacer el patch clamp de la
membrana celular habilitando el mantener el voltaje en un nivel constante
mientras que se graban los cambios de corriente. En forma similar la
corriente en la célula puede ser anclada a la corriente y grabar los cambios
de voltaje. Hay algunas variantes de la técnica de patch clamp que se pueden
realizar incluyendo, por ejemplo:
Patch Clamp
Planar: en lugar de pipetas de vidrio, se usa una superficie plana
puncionada con pequeños hoyos.
Patch
célula-pegada: el electrodo se mantiene sellado a la membrana celular
mientras que la solución en la pipeta se altera (por ejemplo, por la adición
de drogas) y se graba la actividad de los cambios resultantes.
Patch de
adentro hacia fuera: Donde el área “succionada” de la membrana se desprende
de la célula y se expone a la superficie intracelular de la membrana – la
que en cambio se puede exponer a varios medios conteniendo, por ejemplo,
varios ligantes intracelulares.
Patch de
célula completa: Donde se incrementa la succión rompe la membrana y brinda
acceso del electrodo al ambiente intracelular por un periodo de tiempo corto
el ambiente intracelular es diluido por los contenidos de la pipeta.
APLICACIONES:
La técnica
es usada para estudiar células excitables, por ejemplo, aquellas que
producen una pequeña corriente eléctrica cuando se estimulan. Estas incluyen
principalmente células nerviosas y fibras musculares.
CONFIGURACIÓN DEL MICROSCOPIO:
Cualquier
aplicación de electrofisiología incluyendo el patch clamp coloca una gran
demanda en la configuración del microscopio en términos de estabilidad,
supresión de vibración, aislamiento de interferencia eléctrica, espacio para
manipuladores y acceso al espécimen. La estación de trabajo de fisiología
FN1 de Nikon, ha sido diseñada especialmente para cubrir las demandas de
electrofisiología con manipulación eficiente y un ruido mínimo.
SISTEMA
RECOMENDADO:
En el
diseño del FN1, Nikon ha minimizado el ruido eléctrico usando iluminación de
fibra para llevar luz al sistema desde fuera de la jaula y conectando pines
a tierra en todas las partes principales del microscopio. La vibración se
minimiza con la rígida construcción y se reduce el temblor cuando se gira el
porta-objetivos y aumentos. La forma simple y delgada con forma de I en el
cuerpo brinda más espacio de trabajo y un mejor acceso alrededor del
microscopio para posicionar los manipuladores y otros periféricos. El
condensador, sub-platina y torreta se pueden remover por completo del cuerpo
del FN1 para obtener más espacio libre, dependiendo del experimento. Además,
la altura de la platina fija puede cambiarse fácil y rápidamente por el
usuario. Los objetivos de inmersión en agua están aislado de la transmisión
eléctrica y térmica. El objetivo 16x tiene un amplio ángulo de aproximación
de 45° y una distancia de trabajo de 3.0mm para un acceso fácil y una
observación mejorada. La combinación del objetivo 16x (con gran A. N.) en
combinación con un cambiador de aumentos intermedio permite a los usuarios
realizar experimentos de patch clamp sin cambiar el objetivo. El FN1 puede
ser usado en combinación con el sistema confocal C1. Con el eje z motorizado
(opcional) y el software mejorado del C1, los usuarios pueden realizar
análisis de imágenes, reconstrucción 3D de rebanadas, y puede obtener
imágenes 3D y datos electrofisiología alternativos desde el mismo espécimen.
Los usuarios pueden cambiar rápidamente entre la iluminación IR y DIC-IR
para asegurar el reconocimiento preciso de las micro aguja y mejorar el
contraste flexible. El microscopio también permite a los usuarios selecciona
la longitud de onda IR específica para cada tipo de espécimen:
700-750nm
para imágenes de alto contraste de especímenes delgados con estructuras
finas
800-900nm
para imágenes de alto contraste de especímenes gruesos con estructuras
profundas
Oblicua IR
descentrada que brinda contraste flexible desde varios ángulos
LIGAS:
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