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Avances en la tecnología sCMOS benefician la Bio Investigación

 

La tecnología sCMOS esta ganando popularidad - ¿Porqué?

Comparación CCD y sCMOS, ¿mejor o solo diferente?

Como los avances en sCMOS benefician la bio investigación - ¿Qué es optiMOS?

Menor costo de propiedad, sin desempeño comprometido

 

  Descargue la Nota Técnica Advanced sCMOS for Bio Research (ingles)

 

La tecnología sCMOS está ganando popularidad ¿Porqué?

 

En años recientes, la biología celular ha hecho énfasis en las dinámicas de células vivas, sus mecanismos y señales electroquímicas. Conforme esta investigación busca con mayor profundidad en la investigación de fenómenos de cambio rápido, la necesidad de medir eventos de alta velocidad con poca luz se incrementa constantemente. El CMOS Científico con su arquitectura de sensor única permite obtener tanto altos promedios de cuadros para capturar eventos celulares rápidos como un menor ruido para mediciones con mejor cociente señal-a-ruido en los cortos tiempos de exposición requeridos para obtener altos promedios de cuadro.

 

Comparación CCD y sCMOS, ¿mejor o solo diferente?

 

Desde el principio de la microscopia digital, las cámaras CCD de grado científico han sido el estándar dorado para la obtención de imágenes debido a su sensibilidad, respuesta lineal a la luz y sus características de bajo ruido. Sin embargo, varios mecanismos celulares ocurren en escalas de tiempo muy corta y emiten señales luminiscentes bajas, lo que dificulta a las cámaras CCD más lentas la obtención de imágenes con suficiente cociente señal-a-ruido y además con suficiente resolución temporal y espacial. El CMOS Científico se esta convirtiendo en la tecnología de elección para estas aplicaciones de células vivas fluorescentes debido la habilidad del sCMOS de combinar un ruido electrónico muy bajo con altos promedios de cuadros y gran campo de observación.

 

Como con cualquier cosa, decidir si una cámara basada en CCD o sCMOS es una mejor elección depende de la aplicación. El factor prevaleciente a considerar cuando decida entre una cámara CCD o sCMOS es el tiempo de exposición. Las aplicaciones que requieren largos tiempos de exposición que van de minutos a algunas horas, aun es mejor la utilización de cámaras CCD debido a su baja corriente oscura. Estas aplicaciones incluyen bioluminiscencia y quimioluminiscencia de gel Western Blot o la imagen de animales en vivo o electroluminiscencia de materiales semiconductores.

 

Las aplicaciones de Fluorescencia que pueden tolerar grandes tiempos de exposición, incluyendo inmunofluorescencia o células fijas, se encuentran bien tanto con las cámaras sCMOS como con las cámaras CCD. Considerando que estas muestras no son particularmente sensibles a los efectos de fotoblanqueamiento, la mayoría de los investigadores pueden permitirse incrementar los tiempos de exposición para varios cientos de milisegundos con una cámara CCD económica. Ya mencionado, el menor ruido de las sCMOS combinado con su alto promedio de cuadros brindan imágenes de mayor calidad con tiempos de exposición más cortos y promedios de cuadros que facilitan escanear y enfocar la muestra.

 

La obtención de imágenes fluorescentes de células vivas por otro lado es extremadamente sensible a la exposición a la luz. Esto se requiere para minimizar los efectos del foto-blanqueamiento y la foto-toxicidad, así como para capturar tanta información temporal como sea posible. El objetivo es captura imágenes con suficiente cociente señal-a-ruido mientras reducimos la intensidad de excitación y usamos el menor tiempo de exposición posible.

 

Los sensores sCMOS ofrecen una combinación única de bajo ruido electrónico que es cercano a un tercio de la mejor cámara interlineal CCD con un potencial de obtención de cuadros 10x mayor. Estos dos factores por si solos ofrecen considerables ventajas a las cámaras tradicionales CCD para la mayoría de las imágenes de células vivas fluorescentes en aplicaciones de microscopia.

 

¿Cómo benefician los avances en el sCMOS la investigación biológica – Qué es optiMOS?

 

optiMOS es una cámara Científica CMOS y un reemplazo CCD avanzado para beneficiar la investigación biológica ya que está optimizado específicamente para la microscopia fluorescente.

comparcion optiMOS vs CCD

 

Figura 1 Imagen y perfil de comparación de línea de la cámara optiMOS sCMOS de QImaging y una cámara CCD enfriada de grado científico. La calidad de imagen, los niveles señal-a-ruido, campo de observación y promedio de cuadros de la optiMOS son todos superiores a las cámaras CCD científicas. Mientras que los sensores CMOS han estado disponibles por muchos años, un fue hasta hace poco que los sensores de alto desempeño fueron desarrollados beneficiando a los investigadores de ciencias de la vida. El nuevo CMOS científico ofrece una arquitectura única de píxel que puede brindar un tercio de ruido electrónico con un promedio 10x de velocidad de cuadro de una cámara científica CCD. Esto se traduce en menores tiempos de exposición y mayor transferencia de cuadros, reduciendo el daño fotónico a muestras de células e incrementando el detalle temporal capturado en un experimento dado.

 

Cuando cambie a una cámara sCMOS de una CCD para imagen fluorescente, el beneficio obvio más inmediato es la mejora de la calidad de imagen. El bajo ruido electrónico casi triplica el cociente señal-a-ruido y el contraste de la imagen, haciendo posible colectar imágenes de alta calidad con menores tiempos de exposición. Cuadros más limpios combinados con campo de observación un 45% más grande y promedios de cuadro “más rápidos que el vídeo”, facilitan buscar a través de la muestra y capturar imágenes de mayor calidad.

 

El alto promedio de cuadros y el bajo ruido son extremadamente importantes para investigadores específicamente enfocados en dinámicas rápidas de células vivas, incluyendo señales electro-químicas y transporte de proteínas. Para capturar esos eventos mientras se evitan los artefactos de imagen, el promedio de cuadros debe ser lo suficientemente alto para muestrear con precisión el fenómeno celular. Dependiendo del evento, estos promedios pueden ir desde veinte hasta varios miles de cuadros por segundo con tiempos de exposición muy por debajo de 100ms.

 

El tiempo de resolución insuficiente puede resultar en dos tipos de artefactos de imagen: desenfoque de movimiento y alias temporal. El desenfoque por movimiento o el veteado ocurre cuando un tiempo de exposición elegido es muy largo para una velocidad dada de un movimiento del objeto. Por ejemplo, la imagen del transporte axonal de los gránulos secretores envuelven el rastreo de varias partículas conforme se mueven por la neurita celular con cambios rápidos de dirección y velocidad. Si una exposición es suficientemente larga para un gránulo ya sea para que se mueva a una distancia mayor a la fracción de su diámetro o cambio de dirección, entonces un solo cuadro mostrará una línea borrosa resumiendo el camino del gránulo. Este artefacto borroso hace imposible determinar la dirección, ubicación y consecuentemente la velocidad del gránulo. Cuando se hace la imagen de objetos en movimiento y asumiendo la distorsión espacial de no más del 10% es aceptable, el tiempo de exposición requerido para evitar lo borroso por movimiento se puede calcular como:

ecuacion 1

 

Donde:

 

  • theta = tiempo de exposición

  • deltax = la longitud del objeto

  • v= la velocidad del objeto

 

El alias temporal ocurre cuando los intervalos de tiempo entre las exposiciones es demasiado larga para capturar todos los eventos ocurridos o medir con precisión los movimientos del objeto. Por ejemplo, si una neurona esta disparando 100 veces por segundo, el promedio de cuadro de la cámara debe ser lo suficientemente rápido para adquirir una imagen por cada disparo y entre cada disparo. De otra forma, algunos disparos se van a perder o se obtienen imágenes una junto a otra, haciendo imposible distinguir entre un disparo contra varios disparos. Cuan los ciclos de imagen o los eventos oscilatorios como los disparos de neuronas, para evitar el alias temporal el promedio de adquisición debe ser de cuando menos dos veces la frecuencia del evento:

ecuacion 2

 

Donde:

 

  • R = promedio de adquisición

  • F = la mayor frecuencia a ser capturada

 

El alias temporal también puede suceder para comportamientos celulares no cíclicos. Por ejemplo, tráfico de partículas incluyendo la imagen de flujo de sangre en vivo, este requiere un promedio de cuadros que es suficientemente rápido para distinguir movimientos individuales. Si el intervalo entres exposiciones es demasiado largo para que la distancia viajada por dos células sanguíneas es más de la mitad de la distancia entre dos células, entonces se vuelve imposible distinguir el movimiento verdadero de las células sanguíneas y determinar con precisión la dirección velocidad del flujo. Este intervalo se puede definir como:

ecuacion 3

 

Donde:

  • i = intervalo de tiempo de exposición

  • d = la distancia que separa dos objetos en movimiento

  • v = la velocidad del objeto

 

Para evitar cualquier riesgo de alias, asuma que D es equivalente a la longitud del objeto. Dadas estas tres ecuaciones, es posible calcular el promedio de cuadro requerido para una aplicación dada para evitar el desenfoque por movimiento y el alias temporal. Abajo hay unos ejemplos:

 

Evento Celular

Tamaño del objeto

Velocidad del objeto

Promedio de cuadros requerido

Rastreo de células rojas en vivo

10um

1mm/seg.

Exposiciones de 1ms con >1,000 cuadros por segundo (cps) para evitar el desenfoque por movimiento y alias temporal

Transporte axonal rápido de vesículas

100nm

3um/seg.

Exposiciones de 33ms con >60cps para evitar el desenfoque por movimiento y alias temporal

Ondas de calcio durante el desarrollo del corazón

NA

50 – 100 Hz

>100cps para evitar el alias temporal

Disparos de tejido neuronal del cerebro

NA

100 – 1,000 Hz

>200cps para evitar el alias temporal

 

 

Debido al alto promedio de cuadros que es inherente a las cámaras sCMOS, es posible muestrear apropiadamente eventos celulares de alta velocidad y evitar artefactos relacionados con la velocidad. La siguiente tabla brinda un ejemplo de promedio de cuadros típicos con la cámara optiMOS de QImaging:

 

Región de Interés

Promedio de Cuadros

1,920 x 1,080

100cps

1,920 x 512

200cps

1,920 x 128

800cps

1,920 x 64

1,600cps

 

Bajo costo de propiedad, sin desempeño comprometido

 

El optiMOS se ofrece a un precio asociado con cámaras CCD interlineal pero su bajo costo de propiedad no significa un desempeño comprometido. La optiMOS ofrece a los biólogos celulares una solución de imagen sensitiva de alta velocidad, que es amigable al usuario, costeable y evita algunas veces los dolorosos cortes de datos de las cámaras rivales sCMOS. La optiMOS no se compromete en sensibilidad o en promedio de cuadros como se compara a sCMOS alternativos. Ofreciendo ruidos de lectura equivalente a niveles de 1.9e –rms (1.5e- mediana) y 100cps a resolución completa, la optiMOS brinda la misma sensibilidad y resolución temporal pero con un presupuesto mucho más amigable.

 

La arquitectura de píxel entre la optiMOS y cámaras sCMOS de 5 megapíxeles competitivas son idénticas. La única diferencia es el número físico de píxeles (2.1 megapíxeles con la optiMOS contra los 5 megapíxeles de productos competitivos) y cada una tiene sus propias ventajas/desventajas y puntos de precio diferentes.

 

Figura 2 Comparación de Imagen y perfil de región entre la cámara sCMOS optiMOS de QImaging, una cámara enfriada CCD y sCMOS competitivo de 5 megapíxeles. Ambos sensores usa la misma arquitectura del mismo fabricante y por lo tanto, la calidad de imagen y los niveles de señal-a-ruido son equivalentes entre la optiMOS y la sCMOS de 5 megapíxeles. La sCMOS de 5 megapíxeles tiene la ventaja de un campo de observación más grande pero está sujeto a las limitaciones ópticas incluyendo iluminación desigual y aberraciones periféricas así como un incremento de salida de datos que demanda más capacidad de la PC.

 

Mientras que las cámaras sCMOS de 5 megapíxeles no ofrecen una ventaja de un CDO más grande, no significa que no se comprometa. Primero, un arreglo de 5 megapíxeles viene con más miles de dólares. Este costo extra puede valer para algunas aplicaciones, pero solo si el microscopio puede acomodar este gran sensor. Varios microscopios existentes están diseñados ópticamente para sensores de 18mm en diagonal de la cámara digital. Sin embargo un sensor mayor sCMOS, con un tamaño diagonal de 22mm el cual se encuentra fuera de este rango. Esto resulta en iluminación disparejo a través del sensor y una distorsión espacial en los bordes.

 

 figura optimos roll

perdida de foco 5 megapixel

A menos que el microscopio este diseñado específicamente para soportar sensores grandes, se usa típicamente la región central. Consecuentemente, el beneficio de los 5 megapíxeles no se puede explotar en varias configuraciones de microscopios existentes.

 

Adicionalmente, las cámaras de 5 megapíxeles sCMOS corriendo a 100cps generan aproximadamente 1.1GB/s de datos. Para soportar este flujo de datos, se requiere de varios SSD con configuración RAID 0 agregando complejidad y aumentando el valor de la PC en $ 1,000 dólares.

 

Alternativamente, la optiMOS produce aproximadamente 420MB/s a transferencia de cuadro completo. Con este rango de datos, solamente se requiere una unidad SSD PCIe para soportar el flujo continuo a 100cps a la máxima capacidad de la unidad. Esto ofrece ventajas significativas en costo y en simplicidad.

 

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*Basado en ecuaciones presentadas en:

 

Vermont, J Fraser and Lebling M (2008) “Microscopia fluorescente rápida para imagen de dinámicas del desarrollo embrional” Journal HFSP 143-155

 

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